環(huán)氧樹脂生產(chǎn)廢水中含有大量的NaCl，極大地干擾了生化處理，處理難度和成本都很高。這是一種典型的高鹽難降解工業(yè)廢水。目前，這類高鹽廢水的處理方法主要有物理化學(xué)法、生物法和物化-生化組合法。自然界中的耐鹽細(xì)菌生活在鹽湖、鹽堿湖和海水中，對(duì)鹽度的耐受性可達(dá)20%。這些耐鹽細(xì)菌的存在為高鹽廢水的生物處理提供了可能。近年來(lái)，耐鹽細(xì)菌被應(yīng)用于高鹽廢水如榨菜廢水、高鹽皂化廢水的處理，耐鹽細(xì)菌的篩選成為生化處理的關(guān)鍵步驟。本研究從廢水生化處理系統(tǒng)的活性污泥中分離篩選耐鹽細(xì)菌，并對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定和生長(zhǎng)特性研究，以探討耐鹽細(xì)菌在環(huán)氧樹脂廢水中的降解特性，從而為此類含鹽樹脂廢水的處理提供技術(shù)支持。

1.材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用水取自上海某化工廠生產(chǎn)環(huán)氧樹脂的混合廢水，經(jīng)Fenton氧化預(yù)處理后稀釋，并添加適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。水質(zhì)見表1。

細(xì)菌來(lái)源:上海某化工廠和某鎮(zhèn)污水處理廠生化處理系統(tǒng)的活性污泥。

無(wú)機(jī)鹽介質(zhì):硫酸鎂& # 8226；7H2O0.2g克/升，KH2PO40.5g克/升，NH4Cl0.5g克/升，K2HPO41.5g克/升，NaCl(5 ~ 200克/升，根據(jù)需要調(diào)整)，微量元素溶液1毫升。微量元素:CoCl22g/L，NiCl & # 822626H2O0.05g/L，ZnCl20.05g/L，CuCl20.03g/L，F(xiàn)eCl & # 82263H2O 2g/L，MnCl20.5g/L，EDTA1g/L，pH 7.0。

斜面培養(yǎng)基:蛋白胨10g，牛肉醬5g，NaCl5g，KH2PO42g，NH4Cl1g，蒸餾水1000mL，瓊脂20g，pH 7.0。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1耐鹽菌株的篩選

通過(guò)逐漸增加NaCl濃度來(lái)篩選和培養(yǎng)耐鹽細(xì)菌。從上述兩種污泥中各取2.5g，加入裝有100mL無(wú)菌水的已滅菌的250mL三角瓶中，加入無(wú)菌水質(zhì)量0.01%的焦磷酸鈉，搖床破碎微生物群。用無(wú)菌移液管吸取上述泥水混合物，在37℃、150r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)72小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到5% NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中(每代3組平行實(shí)驗(yàn)，傳至第10代)進(jìn)行馴化，直到無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到15%，馴化完成。將馴化后的菌株接種到含有環(huán)氧樹脂生產(chǎn)廢水(COD1000mg/L)的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)72h，得到目標(biāo)菌株。放映結(jié)束了。

分離出的單菌落用涂布瓊脂平板分離，然后將瓊脂平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中72h。瓊脂平板上的菌種長(zhǎng)成菌落后，接種保存在斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行增菌，保存在4℃冰箱中備用。

經(jīng)典分類學(xué)和16SrDNA序列分析用于確定菌株的分類和屬。對(duì)選取的活化菌株進(jìn)行測(cè)序，并在Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，得到較為接近的典型菌株的16SrDNA基因序列。用ClustalX1.8軟件對(duì)與數(shù)據(jù)庫(kù)中高度相似的典型菌株進(jìn)行序列比對(duì)，用MEGA6.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.2菌株生長(zhǎng)曲線

2菌株生長(zhǎng)曲線無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的鹽度梯度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))用NaCl調(diào)至2%、4%、6%、10%，pH用NaOH溶液精確調(diào)至7.0。將富集的菌株在液體無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，然后將10mL菌懸液接種到100mL含不同濃度NaCl的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在搖床中37℃恒溫好氧培養(yǎng)。每2小時(shí)對(duì)菌液OD600取樣。

上述培養(yǎng)基和藥物在121℃滅菌30分鐘備用。

1.2.3耐鹽復(fù)合菌劑量比的確定

通過(guò)對(duì)上述耐鹽細(xì)菌的篩選，得到耐鹽細(xì)菌X1、X2、X3，每個(gè)菌懸液的OD600保持在1.2左右，規(guī)定每1mL菌懸液為1份。根據(jù)正交試驗(yàn)表，將菌懸液按所需比例組合，在50mL廢水中加入5mL復(fù)合菌懸液，在生物搖床中37℃培養(yǎng)24h。測(cè)定了水中的COD，考察了各種組合比例的廢水處理效果，確定了較好的比例。

1.2.4添加耐鹽復(fù)合菌的生物處理

Fenton氧化預(yù)處理后，將環(huán)氧生產(chǎn)混合廢水調(diào)節(jié)至合適的鹽度，并補(bǔ)充合適的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。將50mL處理后的廢水加入250mL三角瓶中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)條件加入耐鹽復(fù)合菌懸液，考察廢水中COD的去除情況。

1.3分析方法

OD600用UV-4802H紫外分光光度計(jì)測(cè)定，CODCr用HZ-HJ-SZ-0108測(cè)定，氨氮用HJ 535-2009測(cè)定，pH用pHS3C酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠)測(cè)定。

2.結(jié)果和討論

2.1耐鹽菌株的篩選

經(jīng)過(guò)對(duì)兩種混合活性污泥的馴化、篩選、富集培養(yǎng)、分離純化，篩選出三株耐鹽細(xì)菌，分別命名為X1、X2和X3。與GenBankBlast軟件的序列同源性比較顯示，三個(gè)菌株均表現(xiàn)出較高的同源性，基于16SrDNA序列分析的進(jìn)化樹如圖1所示。菌株X1被鑒定為產(chǎn)堿桿菌，菌株X2被鑒定為假單胞菌，菌株X3被鑒定為耐鹽芽孢桿菌。

2.2耐鹽菌株的生長(zhǎng)曲線

分別以菌液OD600為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制了三個(gè)耐鹽菌株的生長(zhǎng)曲線，如圖2所示。

從圖2中可以看出，X1和X2可以在2%~10%的NaCl中生長(zhǎng)，X3可以在2%~6%的NaCl中生長(zhǎng)，但鹽度對(duì)該菌株的生長(zhǎng)速度影響很大。隨著鹽度的增加，菌株生長(zhǎng)曲線的適應(yīng)期變長(zhǎng)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的增長(zhǎng)速度變慢。適應(yīng)期較長(zhǎng)的原因是微生物在不同鹽度環(huán)境中接種后，需要一定時(shí)間的調(diào)整和適應(yīng)，合成多種酶進(jìn)一步完善體內(nèi)酶系統(tǒng)后才會(huì)生長(zhǎng)繁殖。而在高鹽環(huán)境下，酶的合成速率下降，產(chǎn)生新的酶系統(tǒng)需要一定的時(shí)間。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，微生物雖然處于營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩狀態(tài)，但在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)速度變慢。在高鹽環(huán)境中，微生物需要花費(fèi)大量的能量來(lái)調(diào)整自己的代謝途徑，或者分泌胞外聚合物來(lái)抵抗外界的不良環(huán)境因素，同時(shí)也需要能量來(lái)合成自身生長(zhǎng)所需的物質(zhì)。因此，用于生長(zhǎng)和繁殖的能量相對(duì)減少，自我生長(zhǎng)率降低，世代時(shí)間延長(zhǎng)。減速生長(zhǎng)期延長(zhǎng)可能是由于底物利用率降低，微生物存活率低，導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)過(guò)剩。

2.3耐鹽復(fù)合菌的生物處理

2.3.1耐鹽復(fù)合菌劑量比的確定

研究表明，利用優(yōu)勢(shì)菌株(如耐鹽細(xì)菌)降解有機(jī)污染物已成為一種有效的方法，微生物菌群處理有機(jī)物的效率高于單一菌株。因此，通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)分離的3株耐鹽細(xì)菌確定了X1、X2和X3的組合比例，從而獲得能夠高效處理環(huán)氧樹脂生產(chǎn)廢水的復(fù)合耐鹽細(xì)菌。正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

從表2可以看出，最佳水平組合為A2、B2和C3，因此三種耐鹽細(xì)菌X1: X2: X3的最佳用量比為2: 2: 3(體積比)。

2.3.2耐鹽組合菌對(duì)Fenton預(yù)處理廢水的降解效果

實(shí)驗(yàn)固定了四個(gè)因子，調(diào)整了另一個(gè)因子，考察廢水中COD的去除效果，如表3和圖3所示。

(1)鹽度。從圖3(a)可以看出，當(dāng)NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%~8%時(shí)，組合耐鹽菌對(duì)廢水中有機(jī)物的降解效果在80%以上。當(dāng)NaCl濃度為15%時(shí)，COD去除率急劇下降，這是因?yàn)殡S著鹽度的增加，菌株的生長(zhǎng)速度變慢，酶的合成受到限制，有機(jī)物的降解速度變慢。因此，組合微生物的最適NaCl濃度為5%~8%。

(2)反應(yīng)時(shí)間。從圖3(b)可以看出，生物搖床在37℃反應(yīng)6h，廢水中COD的去除率達(dá)到54%，12h后去除率約為70%，24h后去除率提高了3%。隨著接觸時(shí)間的延長(zhǎng)，12～48h后COD去除率仍保持在80%以下。

(3)溫度。在圖3(c)中，廢水的COD去除率隨著溫度的升高而逐漸增加，在37℃時(shí)達(dá)到約91%的較大值。當(dāng)溫度達(dá)到40℃時(shí)，COD去除率反而下降，主要是因?yàn)楦邷貢?huì)抑制微生物的活性，從而降低廢水的COD去除率。因此，耐鹽細(xì)菌組合降解有機(jī)物的最適溫度為37℃。

(4)pH值.圖3(d)表明，當(dāng)pH為7時(shí)，廢水的COD去除率較為理想，達(dá)到85%左右；當(dāng)pH值為5和6時(shí)，COD去除率分別為73%和65%左右；當(dāng)pH為9時(shí)，COD去除率僅為30%左右。因此，耐鹽組合菌對(duì)COD的去除效果在pH 7時(shí)較為理想，pH過(guò)低或過(guò)高都會(huì)影響微生物的活性，降低有機(jī)物的降解速率。

(5)細(xì)菌的用量。從圖3(e)可以看出，廢水中COD的去除率隨著細(xì)菌投加量的增加而增加。細(xì)菌投加量為5%的廢水COD去除率明顯高于細(xì)菌投加量為3%的廢水。當(dāng)細(xì)菌投加量為5%和10%時(shí)，COD去除率分別為80%和94%。當(dāng)細(xì)菌投加量為12%時(shí)，COD去除率為98%，但與10%相比降解率有限，因此細(xì)菌的最佳投加量為10%。

綜上所述，在適合耐鹽細(xì)菌生長(zhǎng)的環(huán)境下，用其處理Fenton預(yù)處理后的廢水，COD去除率可維持在70%~80%。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定了最佳實(shí)驗(yàn)條件:pH值為7，反應(yīng)時(shí)間為24h，反應(yīng)溫度為37℃，廢水中NaCl濃度為5%~8%，耐鹽復(fù)合菌的最佳投加量為廢水體積的10%。

3.結(jié)論

(1)對(duì)環(huán)氧樹脂生產(chǎn)廢水處理系統(tǒng)和城鎮(zhèn)污水處理生化池中的活性污泥進(jìn)行馴化，篩選出3株耐鹽細(xì)菌，命名為X1、X2和X3，它們能高效降解廢水的COD，并能在高鹽度環(huán)境中良好生長(zhǎng)。采用16SrDNA序列分析方法進(jìn)行鑒定，分離篩選出3株耐鹽菌株，分別為X1產(chǎn)堿桿菌、X2假單胞菌和X3芽孢桿菌。

(2)通過(guò)正交試驗(yàn)，確定三株菌的最佳劑量比為2: 2: 3(體積比)。用該組合菌處理含鹽量為5%~8%的Fenton廢水時(shí)，耐鹽組合菌的最佳投加量為廢水體積的10%，搖床反應(yīng)時(shí)間為24h，pH值為7，溫度為37℃，能保持較高的COD去除率。(來(lái)源:中海油天津化工研究設(shè)計(jì)院有限公司)

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標(biāo)簽:  環(huán)氧樹脂廢水耐鹽菌株的降解特性